Este artículo es una mera traducción. Una traducción sobre el informe realizado tras el análisis de las botellas de la cerveza más antigua jamás encontradas. Puedes descargar el PDF aquí, con el informe original. También puedes encontrar un artículo que hace mención a las caducidad de las cervezas.




La cerveza más antigua jamás encontrada

Se analizaron dos botellas de cerveza halladas tras un naufragio ocurrido en 1840 (M1 Fö 403.3). Cerca de las Islas Åland en el Mar Báltico. Los componentes del lúpulo y sus compuestos de degradación mostraron que las botellas contenían dos cervezas diferentes. En cuanto al lúpulo, una era más fuerte. Los lúpulos utilizados contenían niveles más altos de β-ácidos que las variedades modernas. Y, se añadieron antes de hervir los mostos, convirtiendo los ácidos α a iso-α-ácidos y β-ácidos a hulupones.

Los altos niveles de ácidos orgánicos, compuestos de carbonilo y glucosa indicaron actividad bacteriana y enzimática durante el envejecimiento. Sin embargo, las concentraciones de compuestos de sabor derivados de levadura fueron similares a las de las cervezas modernas. Excepto que el acetato de 3-metilbutilo fue inusualmente bajo en ambas cervezas. Y el 2-feniletanol, incluso puede que en el 2-feniletil acetato, fueron inusualmente altas en una de las cervezas. Las concentraciones de compuestos fenólicos fueron similares a las de las Lagers y las cervezas modernas.

 

M1 Fö 403.3, la goleta que portaba la cerveza más antigua

En verano de 2010 se descubrió el naufragio de una goleta (M1 Fö 403.3) en el Mar Báltico. A poca distancia al sur de las Islas Åland, Finlandia, a una profundidad de unos 50 metros. La evidencia arqueológica sugiere que el naufragio ocurrió durante la década de 1840. Pero el nombre de la goleta, su destino y su último puerto de escala aún no han sido identificados. La carga consistía en artículos de lujo, incluyendo más de 150 botellas de champán.

También salieron a la superficie cinco botellas que parecen botellas de cerveza típicas de principios del siglo XIX. Uno de estos se rompió en el bote de los buzos. El líquido que emanaba de la botella agrietada parecía y, según los buceadores, sabía a cerveza.

Aunque se ha informado de al menos una muestra de la cerveza más antigua (1825), no tenemos conocimiento de análisis químicos previos de ninguna cerveza de esta edad. Aquí comparamos las características fisicoquímicas. También los perfiles de compuestos de sabor de la cerveza de dos de estas botellas de aproximadamente 170 años. Comparadas con los compuestos de cervezas modernas.

En contraste con el whisky escocés de 100 años excavado en el hielo bajo el campamento base de 1907 de Shackleton en la Antártida y luego analizado minuciosamente, estas cervezas no se han almacenado en condiciones ideales. Como lo demuestra el deterioro de la calidad. Sin embargo, aunque se han producido cambios químicos tanto espontáneos como microbiológicamente, los resultados dan alguna indicación de la naturaleza original de las cervezas y las técnicas utilizadas para fabricarlas.



Abriendo las botellas de cerveza más antiguas del mundo

Las botellas A56 y C49 salieron a flote, sobre la superficie del mar. Y sus corchos y cuellos se protegieron con envolturas de plástico. Estas botellas se mantuvieron almacenadas, en el agua, a una temperatura de entre 2º y 4°C. Se llevaron desde las Islas Åland a los laboratorios de VTT en Espoo, Finlandia. Las botellas se abrieron (en diferentes momentos) en condiciones estériles, ya que también se tomaron muestras para el examen microbiológico (R. Juvonen, M. Raulio, A. Wilhelmson y E. Storgårds).

La parte del corcho que sobresalía de la botella fue cortada. Se taladró un orificio ligeramente inclinado a través del resto del corcho con un taladro esterilizado. Se insertó una aguja quirúrgica con un filtro de aire en el corcho. Con ello permitía que ingrese aire estéril en la botella para reemplazar la cerveza extraída. Durante este procedimiento, el corcho de la botella A56 se rompió horizontalmente en dos piezas. Los dos tercios superiores del corcho se sacaron de la botella a mano.

El tercio inferior permaneció apretado en el cuello de la botella, pero luego cayó en la cerveza durante un intento de quitarlo.) Se insertó una tubería de acero estéril en el fondo de la botella. A continuación, se extrajeron lentamente muestras de cerveza mediante una jeringa a través de esta tubería. Las muestras para análisis fisicoquímicos se centrifugaron dos veces (10 min a 1000 g, luego 10 min a 9000 g). Los sobrenadantes se analizaron inmediatamente o se almacenaron en porciones a -25 ° C. Las muestras (50 ml) para análisis de lúpulo se enviaron a la Universidad Técnica de Munich, Alemania, empacadas en hielo seco.

 

Cervezas de referencia

Botellas de seis cervezas de referencia Leffe Brune, Koff Porter, Weihenstephan Hefe Weissbier, Paulaner Hefe Weissbier, Aldaris Porteris Alus y Olvi Sandels. Estas cervezas fueron compradas a un minorista en Helsinki, Finlandia.




Análisis de la cerveza más antigua jamás encontrada

El agua se desionizó y se filtró a través de carbón activo (Milli-Q Water Sytem, ​​Millipore Corp., Bedford, MA, EE. UU.). El color (método EBC 9.6), amargor (método EBC 9.8), SO2 (método EBC 9.25.3) y nitrógeno amino libre (FAN; método EBC 9.10) se determinaron según lo descrito por la Convención Europea de Cervecería. Se determinaron las gravedades específicas con un densímetro Anton-Paar DMA58. Y se utiliza para calcular los extractos aparentes según el método EBC 9.4. Se estimaron los extractos reales y las gravedades originales a partir de los extractos aparentes y el contenido de etanol mediante el método EBC 9.4. Muestras para análisis de metales se secaron con cenizas. Y luego se disolvieron en ácido nítrico diluido. Los contenidos de sodio y potasio se determinaron mediante espectrometría de absorción atómica de llama usando un PerkinElmer AAnalyst 800.

 

Etanol, glicerol, ácido acético y ácido láctico

Estos compuestos se cuantificaron usando un sistema HPLC-RI (PerkinElmer, Flexar) equipado con columna Aminex (HPX-87H, 300 mm x 7,8 mm; Bio-Rad) en condiciones isocráticas (40 ° C) a un flujo de 0,5 ml min. -1 de H2SO4 2.5 mM.



Azúcares fermentables

Los azúcares fermentables de ésta, la cerveza más antigua, se analizaron mediante cromatografía de intercambio aniónico de alto rendimiento (HPAEC) (Dionex ICS-3000) con detección amperométrica de pulso (PAD) utilizando una columna analítica CarboPac PA-1 (4 mm × 250 mm) y un CarboPac PA-1 (4 columna de protección mm a 50 mm) a 30 ° C (Dionex Corp, Sunnyvale, CA, EE. UU.). El sistema se equilibró con NaOH 100 mM. Después de la inyección de 100 μl de una muestra diluida filtrada (0,45 μm), se pasó NaOH 100 mM a través de la columna (5 min). La separación se logró con un gradiente (1 ml min-1) de NaOH 100-300 mM en 3 min y luego NaOH 300-250 mM + acetato de sodio 75 mM en 15 min, y un paso de lavado final con NaOH 100 mM + 300 mM acetato de sodio y NaOH 300 mM. El caudal fue de 1 ml min-1.

Los resultados fueron confirmados por detección de MSQ (HPAEC-MS) usando un CarboPac PA200 (3 mm × 250 mm) con una columna de protección CarboPac PA200 (3 mm × 50 mm) (Dionex) con una configuración como la descrita por Bruggink et al. ( 4) y un gradiente como lo describen Mikkelson et al.

 

Compuestos amargos derivados del lúpulo

Para la cuantificación de 96 compuestos amargos derivados del lúpulo, las muestras de cerveza se desgasificaron mediante ultrasonidos y se filtraron (0,45 μm), y se analizó una alícuota (5 μL) mediante HPLC-MS / MSMRM como se informó recientemente (6, 7).

Compuestos de sabor derivado de levadura

Estos compuestos en la botella A56 y las cervezas de referencia se determinaron por análisis de GC como se describe y aquellos en la botella C49 por headspace-GC-MS. Se usó 1-butanol como patrón interno. Las muestras (4 ml) de C49 se filtraron (0,45 μm). Y se incubaron a 60 ° C durante 30 minutos. Luego se inyectaron 1 ml (sin división, 260 ° C, flujo = 14,9 ml min-1) en un cromatógrafo de gases (Agilent Serie 6890, Palo Alto, CA, EE. UU.) Combinado con un detector de MS (Agilent 5973 Network MSD, EE. UU.). Y un automuestreador SPME (Combipal, Varian Inc., EE. UU.).

Los analitos se separaron en una columna capilar BPX5 (60 mx 0,25 mm con un espesor de fase = 1,0 μm, SGE Analytical Science Pty Ltd., Australia). El gas portador era helio (1,7 ml min-1). El programa de temperatura fue 50 ° C durante 3 min, 10 ° C min-1 a 100 ° C, 5 ° C min-1 a 140 ° C, 15 ° C min-1 a 260 ° C. Posteriormente, elución isotérmica para 1 min. MSD se operó en modo de impacto de electrones a 70 eV, en el modo de exploración completa (m / z 40-550).

La temperatura de la fuente de iones fue de 230 ° C, y la interfaz fue de 280 ° C. Los compuestos se identificaron por comparación con los estándares auténticos y los espectros de masas en la Biblioteca Espectral de Masa Palisade Complete 600 K (Espectrometría de Masa Palisade, EE. UU.) Y se cuantificaron usando curvas estándar.




Total Vicical Diketones (VDK)

Los VDK se midieron de acuerdo con el método Analytica-EBC 9.10.

 

Compuestos de carbonilo

Los compuestos de carbonilo se analizaron como oximas usando GC-ECD según lo descrito por Ojala et al. A muestras de cerveza de 5 ml se añadieron 500 μL de PFBOA al 0,4% (p / v) (O- (2,3,4,5) , 6-pentafluorobencil) clorhidrato de hidroxilamina) y 100 μL de estándar interno (benzaldehído, 0.1% v / v). Las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante 2 h. La reacción se detuvo mediante la adición de 100 μL de H2SO4 9 M. Y las oximas se extrajeron en 2 mL de hexano.

Las muestras (2 μL, inyección dividida 12.5: 1) se analizaron usando GC-ECD (Agilent 6890 Series). Los analitos se separaron en modo de flujo constante con helio como gas portador (1,2 ml min-1) en una columna capilar DP-5 (30 mx 0,32 mm) con un espesor de fase de 0,50 μm (Agilent). El inyector se mantuvo a 260 ° C, y el ECD se mantuvo a 300 ° C. El programa de temperatura fue de 100 ° C durante 2 min, 8 ° C min-1 a 250 ° C y una retención de 5 min. Los compuestos se identificaron con estándares auténticos y se cuantificaron con curvas de calibración estándar.




Ácidos grasos de cadena corta

Los ácidos grasos de cadena corta se extrajeron con éter dietílico a partir de 4 ml de muestras de cerveza acidificada según lo descrito por Schooley et al. El estándar interno fue ácido heptanoico (C7). Los extractos de éter dietílico (2 μL, inyección sin división) se analizaron mediante GC-FID (serie Agilent 6890). Los analitos se separaron en una columna capilar DP-FFAP (30 mx 0,32 mm, espesor de fase = 0,25 μm, Agilent). El gas portador era helio (2,7 ml min-1). El inyector y el FID estaban a 250 ° C. El programa de temperatura fue de 50 ° C durante 3 min, 25 ° C min-1 a 100 ° C, 10 ° C min-1 a 240 ° C y una pausa de 10 min. Los compuestos se cuantificaron usando estándares auténticos.

 

Ácidos fenólicos enlazados y libres (AP)

Las muestras de cerveza (250 μL) se mezclaron con NaOH 2 M (1,1 mL, para la hidrólisis de PAs unidas) o agua (1,1 mL, para AP libres). Después de 16 h en la oscuridad, las muestras se acidificaron con HCl 5 M y se extrajeron con acetato de etilo (3 x 2 ml). Los extractos se secaron en nitrógeno y los residuos se disolvieron en 0,5 ml de metanol, se filtraron y se usaron para cuantificar AP libres y totales mediante cromatografía líquida de ultra-rendimiento (UPLC). Las porciones (200 μL) de las muestras de metanol se secaron y se disolvieron en 30 μL de diclorometano (DCM) y se derivatizaron con MSTFA (N-metil-N-trimetilsililtrifluoroacetamida, Pierce, Rockford, IL, EUA; 25 μL, 80 ° C durante 20 min) para el análisis GC-MS de AP menores.




Fenoles volátiles

Las muestras de cerveza (0,5 ml) se sometieron a agitación vorticial. Se enriquecieron con ácido heptadecanoico (10 μg) y se extrajeron con DCM (2 x 4 ml). Los extractos de DCM separados se secaron en nitrógeno y se redisolvieron en 100 μl de DCM. La mitad (50 μL) de cada extracto se trimetilsililó con MSTFA (25 μL, 80 ° C durante 20 min). Las muestras derivatizadas y no derivatizadas se analizaron mediante GC-MS.

Los compuestos fenólicos se analizaron usando UPLC y GC-MS. Una Waters Acquity UPLC estaba equipada con una columna Waters Acquity BEH C18 (1,7 μm, 2,1 × 100 mm). Combinada con una precolumna VanGuard (2,1 × 5 mm 1,7 μm). El disolvente fue ácido fórmico al 5% y acetonitrilo. El flujo fue de 0,43 ml min-1. La proporción de acetonitrilo aumentó linealmente del 5 al 90% en 9 minutos y volvió al 5% en 2 minutos.

Matriz de diodos

El detector de matriz de diodos se usó a 190-600 nm. Los ácidos ferúlico, sinapic y p-cumárico se cuantificaron a 320 nm utilizando curvas estándar de compuestos auténticos (0,1-100 μg ml-1). Para los análisis de GC-MS, un Agilent 7890A GC estaba equipado con un detector selectivo de masas 5975C y columna capilar de sílice Rtx-5MS (15 m, 0,25 mm de diámetro interno, espesor de fase de 0,25 m (Restek, Bellefonte, PA, EE.UU.)).

La temperatura del horno se aumentó de 70 ° C (1 min) a 10 ° C min-1 a 270 ° C (4 min). La relación de división fue 25: 1, y las muestras fueron inyectadas por un sistema de muestreo Gerstel Maestro MPS 2 (Gerstel GmbH & Co.KG, Mühlheim an der Ruhr, Alemania). Los datos se recopilaron en el modo de exploración completa (m / z 40-600). Los compuestos se identificaron por tiempos de retención y comparación de la biblioteca (NIST ’08, Scientific Instrument Services, Inc., Ringoes, NJ, EE. UU.).



Contenido de proteínas

Las proteínas se precipitaron de cervezas (400-500 μL) con acetona (1600 μL) a -20 ° C. Los precipitados de la centrifugación (720g, 5 min) se disolvieron en 25 l de tampón de rehidratación (2 M tiourea, 7 M urea, 0,5% de Triton-X-100, 0,5% Pharmalyte 3-10) y se ensayó por 2-D Kit Quant ( GE Healthcare UK Limited, Buckinghamshire, Reino Unido) con albúmina sérica bovina como estándar.

Aminoácidos

Los aminoácidos totales y libres se analizaron con la solución de aplicación de análisis de aminoácidos Mass TRAK (Waters, Milford, MA, EE. UU.). Las muestras para aminoácidos totales se hidrolizaron en HCl 6 N a 110 ° C durante 20 h. Luego se secaron en nitrógeno. Se disolvieron en 200 \ mu l de agua, se secaron y se disolvieron en 200 \ mu l de HCl 0,1 N. Las muestras hidrolizadas y no tratadas (10 μL) se mezclaron con patrón interno (10 μL de norvalina 250 μM). Se derivatizaron (kit de reactivo FluQ AccQ · Waters). AccQ. Se añadió reactivo de flúor (20 μL) y tampón de ácido bórico (70 μL). La mezcla se sometió a vortex durante 60 s. El análisis UPLC-MS involucró un sistema Acquity UPLC (Waters) con un detector de matriz de diodos.

La cromatografía implicaba una columna Acquity Mass TRAK (2,1 x 150 mm, 1,7 μm) (Waters) a 43 ° C. El volumen de inyección fue de 2,0 μL. La separación se logró por gradiente de elución con 10% (v / v) de Análisis de Aminoácidos Concentrado A en agua y Aminoácido Análisis Eluyente B a 0,4 ml min-1, controlando el efluente a 260 nm.




Resultados del análisis de la cerveza más antigua del mundo

Botellas

Las botellas A56 y C49 eran botellas de vidrio marrón similares, 245 mm de alto incluyendo el cuello de 80 mm. Los diámetros aumentaron de 85 mm en la base a 90 mm en el hombro. Los cuellos tenían aproximadamente 37 mm de diámetro. Las bases tenían depresiones cónicas de unos 40 mm de profundidad (como en las botellas de vino tradicionales).

La botella A56 no mostró signos de abrasión de la arena ni corrosión del vidrio. (Risto Aalto, Riikka Alvik, Markku Annila, Ulla Klemelä y Kaisa Koivisto, comunicación personal). Parecía haber sido soplado mientras giraba en un molde cilíndrico, que formaba la pared (las marcas del molde eran visibles en la pared). Al parecer, la boca de la botella se formó envolviendo con tiras de vidrio caliente alrededor del cuello cortado. No se conservaron etiquetas en ninguna de las botellas. Ambas botellas estaban cerradas con corchos de grano grueso que sobresalían varios milímetros del cuello.

La formación de gas

Durante el muestreo se forman burbujas de gas, presumiblemente CO2, que producen una espuma ligera. Ambas cervezas eran de color amarillo dorado brillante, con poca bruma. Ambas cervezas olían a levadura autolizada. A sulfuro de dimetilo, baquelita, goma quemada, queso demasiado maduro y cabra, con notas fenólicas y de sulfuro. Cuando las muestras se calentaron a temperatura ambiente, el olor a sulfuro de hidrógeno desapareció y el del ácido butírico (particularmente fuerte en C49) se fortaleció.



Análisis fisicoquímicos

Comparadas con las cervezas modernas, las cervezas de naufragio contenían niveles similares de potasio pero 15-60 veces más sodio, presumiblemente derivado del agua de mar. Esto puede haber diluido las cervezas hasta en un 30%. Los contenidos de etanol fueron bajos (2.8-3.2% ABV) en comparación con las cervezas y cervezas modernas típicas. Las proporciones de masa de glicerol / etanol fueron del 4,5% para ambas cervezas naufragio, lo que es típico para un producto de fermentación de levadura. Ambas cervezas eran ácidas, con pH alrededor de 1 unidad por debajo de los valores modernos. Las resistencias de color estaban en el rango de cervezas ale y cervezas modernas (y mucho más bajas que las de porters o stouts).

La amargura fue menor en A56 (9.9 IBU, que corresponde a una cerveza light moderna) y mayor en C49 (16 IBU). El dióxido de azufre no se detectó en A56 (no se probó en C49): el dióxido de azufre original probablemente se oxidaría durante los 170 años bajo el agua. El VAN fue bajo (61 mg L-1) para A56 pero normal (114 mg L-1) para C49. Los niveles de proteína (5-7 mg L-1) fueron muy bajos en ambas cervezas.

Azúcares fermentables

Una pequeña cantidad de maltosa estaba presente en A56 y mucho más en C49. En la C49  contenía más maltosa que la típica en las cervezas modernas. Ambas cervezas contenían menos maltrotriosa que maltosa, mientras que las cervezas modernas contienen más maltotriosa que maltosa. Ambas cervezas, especialmente C49, contenían cantidades inesperadamente grandes de glucosa (la glucosa se consume por lo general al principio de la fermentación).

La fructosa y la sacarosa no se detectaron en ninguna de las dos naufragios. Al igual que la glucosa, estos azúcares se consumen en la fermentación temprana (su presencia sugiere endulzar deliberadamente).

Los extractos aparentes (1.32 ° Platón para A56 y 3.10 ° Platón para C49) se encontraban en el extremo inferior del rango para cervezas ale y lagers modernas. Los extractos reales, calculados a partir de los extractos aparentes y las concentraciones de etanol, fueron 2.24 ° Platón (A56) y 3.98 ° Platón (C49). No se midieron los niveles totales de carbohidratos, pero la diferencia entre los extractos reales y los azúcares y sales residuales sugiere que el almidón todavía estaba presente a aproximadamente 17 g L-1 (A56) y 25 (C49) g L-1.




Componentes de Lúpulo

Las cervezas del naufragio contenían pequeñas cantidades de algunos iso-α-ácidos, que se consideran los compuestos amargos clave en la cerveza. Entre estos iso-α-ácidos, cis-isohumulona y cis-isocohumulona se encontraron en ambas cervezas, mientras que isómeros adicionales fueron detectables solo en C49. Además de los iso-α-ácidos, se detectaron algunos de sus productos de degradación. Tales como productos de degradación tri- y tetracíclicos, alo-iso-α-ácidos, escorpiohumols y los triciclohumolactoles. Estos compuestos se forman después del envejecimiento de la cerveza mediante una degradación catalizada por ácido de ácidos iso-α.

Además, se encontraron hulupona y ácido hulupínico como productos de degradación de ácidos β de lúpulo. Solo se detectaron pequeñas cantidades de xantohumol, isoxantohumol y 6- y 8-prenilnaringenina, aunque su presencia se confirmó de manera inequívoca. Los hidroperóxidos de alo-iso-α-ácidos, los productos de degradación tricíclicos de β-ácidos, e hidroperóxidos e hidróxidos de tricicluponas son derivados de lúpulo conocidos, (12-14) pero no se detectaron en ninguna cerveza de naufragio.

Sin embargo, su ausencia no es inesperada ya que son susceptibles a la degradación química de la autooxidación y reacciones catalizadas por ácido. En C49, pero no en A56, se detectaron una serie de productos de oxidación de los ácidos α, iso, α y β tales como humulinones, hidróxidos de alhumulón y ácidos humulínicos. La mayoría de los otros compuestos derivados del lúpulo presentes en A56 se detectaron en C49 en concentraciones más altas. La mayor concentración de la mayoría de los componentes del lúpulo en C49 que en A56 concuerda con el amargor más pronunciado de C49.

Compuestos de sabor derivado de levadura

Las levaduras producen compuestos que contribuyen al sabor de las bebidas fermentadas. Algunos de estos compuestos fueron analizados en las cervezas naufragio y seis cervezas de referencia. Los resultados se normalizaron a una concentración estándar de etanol de 35 g L-1. Las concentraciones (normalizadas) de la mayoría de los compuestos en las cervezas del naufragio estaban dentro o cerca del rango encontrado en las cervezas de referencia.

Sin embargo, hubo excepciones. El acetaldehído, con un Tb (umbral de sabor en la cerveza) de 25 mg L-1 (a menos que se indique lo contrario, los umbrales de sabor en las descripciones de cerveza y sabor son de Meilgaard) y un sabor de hoja verde relativamente alto en C49 -propanol (Tb = 800 mg L-1, alcohol) en ambas cervezas naufragio. El acetato de 3-metilbutilo (Tb = 1.6 mg L-1, banana) fue marcadamente bajo en ambas cervezas naufragio.

El hexanoato de etilo (Tb = 0.23 mg L-1; manzana) fue alto en ambas cervezas naufragio, especialmente en C49. El decanoato de etilo (Tb = 0.9 mg L-1; manzana dulce) fue alto en A56 (y también en la cerveza Olvi Sandels). El 2-feniletanol (Tb = 125 mg L-1; rosa) fue alto en A56 y ligeramente alto en C49. El acetato de 2-feniletilo (Tb = 3.8 mg L-1; rosa) fue posiblemente alto en A56, pero bajo en C49.




Compuestos de carbonilo

También se midieron en A56 y en las cervezas de referencia dos dicetonas vecinas, que también son derivadas de levadura y pueden causar un sabor mantecoso o parecido al caramelo, considerado inaceptable en lagers pero apreciado en algunas cervezas. Las concentraciones normalizadas de diacetilo (Tb = 150 μg L-1) fueron 36 μg L-1 para A56 en comparación con 15 μg L-1 para Olvi Sandels y 34-64 μg L-1 para las otras cervezas de referencia. La pentanodiona (Tb = 900 μg L-1) fue baja en A56 (7 μg L-1) y estaba por debajo de la concentración promedio (14 μg L-1) encontrada en las cervezas de referencia. Los niveles de otros cuatro compuestos de carbonilo en la cerveza de naufragio A56 y las cervezas de referencia se comparan en la Figura 3 (no se mide en C49).

Todas las cervezas contenían entre 3.2 μg L-1 (Olvi Sandels) y 16.5 (Leffe Brune) μg L-1 3-methylbutanal (Tb = 600 μg L-1, banano verde). Hubo una mayor variación para los otros carbonilos. Para 2-metilpropanal (Tb = 1000 μg L-1; banana, melón), las cervezas de referencia contenían entre 3,3 μg L-1 (Olvi Sandels) y 51 (Koff Porter) μg L-1, mientras que la cerveza de naufragio contenía 58 μg L- 1. El fenilacetaldehído (Tb = 1600 μg L-1; jacinto) no se pudo detectar en la cerveza del naufragio y estaba entre 5,7 μg L-1 (Weihenstephan Weissbier) y 25 (Koff Porter) μg L-1 en las cervezas de referencia. El furfural (Tb = 150 mg L-1) varió entre 29 μg L-1 (Sandels Olvi) y 240 (Koff Porter) μg L-1 en las referencias y fue mucho más alto (664 μg L-1), pero aún por debajo del umbral , en la cerveza naufragio.

 

Fenólicos

Se midieron varios compuestos fenólicos en las cervezas de naufragio y tres cervezas de referencia. Entre estas cinco cervezas, la cerveza de trigo, Paulaner Weiss, fue excepcional. Contenía al menos 5 veces más 4-vinilguaiacol y 2 veces más 4-vinilsiringol que cualquier otra cerveza y exhibía las mayores concentraciones de ácido sinapic y 4-hydroxyphenylethanol y las concentraciones más bajas de p-cumárico, cafeico y 4-hidroxifenilacético ácidos. Las proporciones de ácidos hidroxicinámicos libres en comparación con los ácidos hidroxicinámicos totales fueron mucho más pequeñas (0% ferúlicas, 5% sinapicas y 15% p-cumáricas) para Paulaner Weiss que para todas las demás cervezas (7-17% ferúlicas, 9-22% sinapicas y 61-78% p-coumaric).

Las cervezas del naufragio se parecían más a las otras referencias, Olvi Sandels (una cerveza dorada) y Koff Porter. Las concentraciones totales de ácidos fenólicos en las cervezas de naufragio estuvieron dentro de ± 60% de las de las referencias de Olvi Sandels y / o Koff Porter, excepto que los ácidos vanílicos y 4-hidroxifenilacéticos fueron 2-3 veces más altos en las cervezas de naufragio. A56 contenía más 4-vinilguaiacol que las referencias de Olvi Sandels y Koff Porter, pero mucho menos que Paulaner Weiss. 4-Ethylguaiacol estaba por debajo del límite de cuantificación en todas las cervezas.




Aminoácidos

Después de la hidrólisis ácida, los aminoácidos principales (totales) en las cervezas de naufragio fueron glutamato / ácido glutámico, prolina y glicina. La composición de aminoácidos de las cervezas de naufragio era similar a la de las cervezas comerciales modernas, excepto que las cervezas de naufragio tenían relativamente más prolina y alanina y menos asparagina / ácido aspártico. Proline fue el principal aminoácido libre en ambas cervezas naufragio. Los perfiles de aminoácidos de las dos cervezas fueron similares, pero C49 tenía una mayor proporción de glicina libre y una proporción menor de treonina y prolina libre que A56. Se encuentran diferencias de la misma magnitud entre diferentes cervezas modernas.

Discusión

La forma general y las características detalladas de las botellas A56 y C49 indican una tecnología de alta calidad que todavía no se utilizaba en Finlandia en 1840, pero que se había utilizado para fabricar botellas de cerveza durante dos o tres décadas en Europa central y septentrional (comunicación personal; Aalto, Riikka Alvik, Markku Annila, Ulla Klemelä y Kaisa Koivisto). La presencia de componentes del lúpulo (ampliamente degradado), maltosa y maltotriosa identifica el contenido de las botellas como cervezas. Las concentraciones más altas de componentes del lúpulo en la cerveza C49 que en A56 no pueden explicarse por diferentes grados de degradación química o dilución por agua de mar e indica que las botellas contenían dos cervezas diferentes.



Cervezas naufragadas

Ambas cervezas naufragadas contenían muy poca proteína para permitir la identificación de proteínas mediante electroforesis en gel 2D. La mayor parte de la proteína original probablemente se hidrolizó (p. Ej., Por actividad proteolítica de bacterias de ácido láctico) y se consumió parcialmente por microorganismos durante el envejecimiento (ambas cervezas contenían grandes cantidades de bacterias muertas y levadura).

Los péptidos que pueden haberse liberado por hidrólisis y todavía presentes en la cerveza no habrían sido detectados en el ensayo de proteína empleado ya que la etapa de precipitación con acetona es mucho menos eficaz para los péptidos que para las proteínas. Los perfiles de aminoácidos de ambas cervezas eran muy similares a los de las cervezas comerciales modernas. Claramente diferentes de, por ejemplo, el de la sidra de manzana.

Características tales como el contenido de prolina libre relativamente alto son consistentes con la materia prima el material es grano de cereal pero no distingue entre cebada y trigo, que tienen perfiles de aminoácidos muy similares.  Además, los perfiles de aminoácidos de las cervezas naufragadas han sido perturbados por la actividad de contaminantes microbianos.

 

Los compuestos amargos del lúpulo

La presencia de compuestos amargos derivados del lúpulo confirma el uso del lúpulo para amargar las cervezas. La ebullición de la caldera induce la transformación de los ácidos α a iso-α-ácidos y la de β-ácidos a hulupones. La falta de α- y β-ácidos y la presencia de iso-α-ácidos y hulupones por lo tanto indican que los lúpulos se agregaron a los mostos antes de hervir el hervidor. Las cantidades de cis-iso-α-ácidos fueron más altas que las de los trans-iso-α-ácidos correspondientes, lo que está en consonancia con la mayor estabilidad de los cis-iso-α-ácidos y los hallazgos de la literatura que trans-iso-α -Los ácidos se transforman fácilmente en tri- y tetraciclohioles, escorpiohumols y triciclolactohumols por catálisis de protones durante el envejecimiento de la cerveza.

En comparación con las cervezas modernas, se detectaron cantidades bastante altas de estos cuatro compuestos. Por ejemplo, se encontraron 7,76 y 4,24 μmol L-1 de tri- y tetraciclociclohumol en C49. En comparación con 1,00 y 0,46 μmol L-1 en una cerveza fresca de tipo Pilsner. Los altos niveles de estos productos de envejecimiento pueden explicarse por el pH bajo. Y, el “tiempo de reacción” prolongado en el naufragio. Curiosamente, las cantidades inesperadamente grandes de productos de degradación de ácido β huluponas y ácido hulupínico son consistentes con las variedades de lúpulo antiguo que contienen niveles más altos de ácidos β que las variedades modernas. Que se han criado para maximizar el contenido de ácido α.




Falta de hidróxidos e hidroperóxidos

La falta de hidróxidos e hidroperóxidos de los ácidos iso-α y β en la cerveza A56 indica que la degradación de los componentes del lúpulo se debió principalmente a reacciones catalizadas por protones en lugar de a la autooxidación que involucraba oxígeno. Por el contrario, la cerveza C49 contenía productos de oxidación de los ácidos α, iso y ácidos beta tales como hidróxidos de ácidos alo-iso-α, huluponas y ácidos humulínicos, lo que indica claramente la autooxidación de los componentes del lúpulo durante el envejecimiento. Estas diferencias pueden deberse en parte a la entrada de aire después del embotellado de C49. Pero también sugieren que las dos cervezas se originaron en diferentes lotes de lúpulo.

Ambas cervezas naufragadas contenían mucho más sodio que lo habitual en las cervezas. Presumiblemente, los iones Na + difundidos en las cervezas a través del corcho o el agua de mar entraron en las botellas. Suponiendo concentraciones promedio durante los últimos 170 años de 3000 mg Na L-1 y 100 mg KL-1 en el mar alrededor del pecio a 50 m de profundidad (la salinidad del Báltico varía con el tiempo, la ubicación y la profundidad), las cervezas pueden han sido diluidos con agua de mar hasta en un 30%.

Las concentraciones de otros analitos pueden ser demasiado bajas hasta en un 30% solo por esta causa. Esto puede explicar los bajos niveles de etanol en las cervezas. Las concentraciones se normalizan a 35 g de etanol L-1. Lo que corrige la dilución simple. Y proporciona una comparación más significativa con las cervezas de referencia.

 

Las propiedades organolépticas de la cerveza del naufragio

Las propiedades organolépticas predominantes de ambas cervezas de naufragio eran desagradables (ácidas, saladas, quemadas, sulfurosas, etc.). Estas cualidades negativas enmascaran cualquier sabor afrutado, maltosidad o espejismo. Los niveles de varios ácidos orgánicos fueron inusualmente altos en las cervezas del naufragio. Lo que presumiblemente causó su bajo pH y sabores de leche avinagrado, de cabra y amargo. La microscopía óptica y electrónica reveló numerosas bacterias en ambas cervezas. Y cuatro especies de bacterias del ácido láctico (no formadoras de esporas) se recuperaron mediante cultivo (R, Juvonen, M. Raulio, A. Wilhelmson, y E. Storgårds, E; manuscrito en preparación).

Los ácidos orgánicos encontrados en las cervezas se pueden producir por actividad bacteriana. Por ejemplo, las bacterias de ácido láctico pueden producir varios ácidos grasos volátiles así como también mayores cantidades de ácidos lácticos y acéticos. En la década de 1840, la “higiene microbiológica” era una cuestión de ensayo y error con experiencia empírica. Pero no con base científica. Los sabores que ahora se sabe que son causados ​​por bacterias pueden haber sido intencionados (como en el caso de las cervezas Geuze belgas) o fallas de producción.

En cualquier caso, la actividad bacteriana continuó después del naufragio y eventualmente produjo cantidades inadmisiblemente grandes de ácidos orgánicos. La presencia de bacterias vivas, que no forman esporas, significa que las células vegetativas se han metabolizado continuamente, aunque lentamente, durante aproximadamente 170 años.



La comparación de la cerveza más antigua con las cervezas modernas

En comparación con las cervezas modernas, la cerveza A56 contenía menos maltosa y ambas cervezas contenían mucha menos maltotriosa y concentraciones relativamente altas de glucosa. Una explicación plausible es que después de la fermentación inicial (impulsada por levadura), los microbios contaminantes excretaron enzimas (por ejemplo, amiloglucosidasa) capaces de degradar los carbohidratos residuales a glucosa.

Este suministro de glucosa probablemente apoyó el crecimiento y la actividad fermentativa de las bacterias de ácido láctico y otros microbios. A medida que las condiciones empeoraron (por ejemplo, aumentó la acidez), la producción de glucosa excedió la capacidad fermentativa de los microbios viables restantes. Y la glucosa comenzó a acumularse. Esta hipótesis explicaría la alta glucosa y baja maltotriosa en las cervezas naufragio. Pero no explica de forma inmediata la maltosa relativamente alta en la cerveza C49.

A pesar de las características organolépticas desagradables probablemente resultantes de la descomposición bacteriana, los análisis químicos revelaron perfiles de compuestos de sabor derivados de levadura ampliamente similares a los de las cervezas modernas. Hubo algunas peculiaridades notables.

 

El carácter original

Ambas cervezas contenían muy poco acetato de 3-metilbutilo, pero niveles bastante altos de 2-feniletanol y 1-propanol; A56 contenía un alto nivel de acetato de 2-feniletilo, pero C49 contenía muy poco. A56 (pero no C49) contenía un alto nivel de decanoato de etilo. Y C49 contenía especialmente un alto nivel de hexanoato de etilo. Un problema es determinar en qué medida estos resultados reflejan el carácter original de las dos cervezas en lugar de los cambios químicos durante 170 años a aproximadamente 4 ° C.

Hasta donde sabemos, no hay estudios de la estabilidad química de la cerveza durante tanto tiempo. Vanderhaegen et al. estudiaron la estabilidad de la cerveza de alta fermentación durante 6 meses a 0, 20 o 40 ° C.

Las tasas de cambio fueron muy sensibles a la temperatura. Muchos compuestos que cambiaron marcadamente en 6 meses a 20 o 40 ° C se mantuvieron estables a 0 ° C. Las cantidades de acetato de etilo y acetato de 3-metilbutilo disminuyeron en 25 y 60%, respectivamente, a 40 ° C, pero no cambiaron a 0 ° C. Por lo tanto, posiblemente ambas cervezas de naufragio originalmente contenían solo un pequeño 3-metilbutil acetato. Un importante componente de sabor (banana) de las cervezas modernas. Probablemente, su concentración ha disminuido durante el largo envejecimiento.

 




Fermentación espontánea

Las cervezas Lambic contienen poco acetato de 3-metilbutilo, y se cree que es el resultado de la actividad de una esterasa producida por las levaduras Dekkera (Brettanomyces) durante la fermentación lambic. Considerando la falta de compuestos de etilfenol en las cervezas, puede ser más que probable que una esterasa derivada de células de Saccharomyces lisadas haya contribuido a la pérdida de acetato de 3-metilbutilo.

Vanderhaegen y otros encontraron que el hexanoato de etilo, el octanoato y el decanoato en la cerveza disminuyeron rápidamente durante el almacenamiento a 20 o 40°C. Y el octanoato de etilo y el decanoato disminuyeron en 10 y 25% durante 6 meses a 0 ° C. Malfliet et al. observaron una disminución similar de las concentraciones de compuestos de sabor en un rango de cervezas modernas almacenadas a 30°C durante 60 días o a 22 ° C durante 9 meses.

Por lo tanto, los niveles originales de hexanoato de etilo en ambas cervezas naufragio y de decanoato de etilo en la cerveza A56 eran probablemente al menos tan altos como se muestra en la Figura 2 y habrían aportado sabores afrutados (manzana) a las cervezas frescas.

Hexanoato de etilo

El hexanoato de etilo estaba por encima de su umbral de sabor de 0.2 mg L-1 en ambas cervezas. Sin embargo, si estuviera presente una esterasa apropiada, estos ésteres podrían, en cambio, haberse formado en las botellas a partir de etanol y ácidos hexanoico y decanoico producidos por microorganismos de descomposición, de modo que los niveles pueden sobreestimar los de las cervezas frescas.

El nivel de 1-propanol puede haberse incrementado por las interacciones metabólicas de las bacterias del ácido láctico. Lactobacillus buchneri puede convertir el lactato en 1,2-propanodiol, que Lactobacillus diolivorans puede convertir aún más en 1-propanol y ácido propiónico.




La falta de estudios de estabilidad

No encontramos estudios de estabilidad a largo plazo para el feniletanol. Malfliet y otros observaron que la concentración de acetato de feniletilo se redujo en un 10-20% durante el envejecimiento. Lo que posiblemente explica el nivel relativamente bajo de este compuesto. En comparación con el feniletanol en la cerveza C49. La concentración de feniletanol en la cerveza A56 naufragio fue casi el doble que la de las cervezas modernas. Pero aún por debajo del umbral de sabor de 125 mg L-1. El acetato de feniletilo en la cerveza A56 (0,68 mg L-1), aunque mayor que en las cervezas de referencia, estaba por debajo de su umbral de sabor (3,8 mg L-1).

Se sabe que los compuestos presentes en concentraciones inferiores a sus concentraciones umbral de sabor pueden contribuir al sabor general de las cervezas debido a los efectos sinérgicos, de modo que en las cervezas modernas típicas el feniletanol y el acetato de feniletilo contribuyen al sabor floral general, en lugar de impartir un sabor de rosa específico. Sin embargo, las concentraciones más altas de estos compuestos en una o ambas cervezas de naufragio pueden haber introducido notas rosas más claras.

Al menos las cepas de sake de S. cerevisiae pueden evolucionar para producir altos niveles de feniletanol. Los niveles inusualmente altos de fenilalanina en el mosto también pueden dar lugar a niveles más altos de feniletanol. Además, la absorción aumentada de la fenilalanina se produce a temperaturas más altas. Y puede contribuir a concentraciones más altas de feniletanol en vinos fermentados a temperaturas más altas.

Temperaturas de fermentación

Las temperaturas de fermentación estuvieron mal controladas en la década de 1840. Y pueden haber sido relativamente altas durante el verano. Sin embargo, las altas concentraciones de feniletanol también podrían haber sido causadas por levaduras no Saccharomyces en el proceso de elaboración. En la década de 1840, las culturas de levadura pura eran un concepto desconocido. La fermentación superior seguía siendo el método principal. Las fermentaciones se realizaron en recipientes de madera abiertos. Estos proporcionaban buenas superficies de fijación para los microbios y eran difíciles de limpiar.

Las fermentaciones estuvieron abiertas a contaminación en el aire. Y se lanzaron con toda la microbiota recogida de una fermentación previa mediante el desnatado. Esto podría haber incluido varias levaduras que hoy están clasificadas como contaminantes de la cervecería. Incluidas Dekkera spp., Kluyveromyces marxianus y Hanseniaspora spp. que puede producir altos niveles de feniletanol.

El nivel de diacetilo total (es decir, diacetil libre más su precursor de ácido α-acetoláctico) en cerveza A56 estaba dentro del intervalo típico para cerveza. Mientras que la concentración total de pentanodiona era baja (estas dos dicetonas vecinas no se analizaron en cerveza C49). En contraste con esto, Vanderhaegen et al. encontraron grandes aumentos en el diacetilo (3 veces a 0 ° C, 50 veces a 40 ° C) y pentanodiona (30% a 0 ° C y 8 ​​veces a 40 ° C) durante el almacenamiento de cerveza fermentada durante 6 meses.

 




El envejecimiento de la cerveza A56

Aparentemente esto no sucedió durante el envejecimiento de la cerveza A56. Más bien, esta cerveza puede haber contenido inicialmente niveles bajos de α-acetolactato y el precursor de 2,3-pentanodiona α-acetohidroxibutirato. Pero una temperatura de fermentación alta y un pH bajo debido a la actividad bacteriana en los recipientes de fermentación abiertos podrían haber favorecido la descarboxilación oxidativa rápida de los ácidos α-acetohidroxi. Y la reducción inducida catalizada por levadura de las dicetonas vecinas. Resultantes a los alcoholes correspondientes, neutros en cuanto al sabor.

La cerveza naufragio A56 contenía un poco más de 2-metilpropanal que los dos portadores de referencia. Pero mucho más que la cerveza dorada (Olvi Sandels). El 2-metilpropanal aumenta durante el envejecimiento, y los niveles en la cerveza A56 son similares a los de las cervezas pálidas envejecidas durante 6 meses a 22 °C.

Falta de oxígeno

El nivel de 3-metilbutanal en A56 fue aproximadamente el doble que en Olvi Sandels. Pero menor que el que se encuentra en las modernas cervezas de trigo y porteros. Los niveles de 3-metilbutanal pueden aumentar 6 veces. Alcanzando 21-43 μg L-1 durante el almacenamiento de cervezas fermentadas y cervezas superiores. Especialmente en presencia de oxígeno. El valor relativamente bajo para 3-metilbutanal en la cerveza A56 sugiere que esta botella no contenía mucho oxígeno. O que las reacciones que condujeron a su formación fueron muy lentas. A temperaturas profundas del mar Báltico (aproximadamente 4 ° C).

Esta suposición está claramente respaldada. Por el hecho de que, a diferencia de la cerveza C49, no se detectaron productos de oxidación derivados de lúpulo de los ácidos α, iso, α o β en la cerveza A56.

El furfural se forma durante el envejecimiento de las cervezas. Sin embargo, su nivel fue menor que (2500 μg L-1) alcanzado durante el envejecimiento de una cerveza moderna durante 6 meses a 40 °C. Y mucho menos que el sabor informado umbral en la cerveza (150,000 μg L-1). Sin embargo, A56 contenía mucho más furfural (660 μg L-1) que cualquiera de las cervezas de referencia y mucho más que una cerveza moderna (29 μg L-1 para Olvi Sandels). También podría haberse formado térmicamente durante el macerado. Es de suponer que el puré y el mosto se calentó sobre un fuego abierto. Ello requiere una agitación muy eficaz. Para evitar la quema de parches locales de puré contra la pared interior de la olla. Si el sabor quemado resultante (no necesariamente del furfural mismo) se percibió como positivo o negativo no está claro.

 



Paulaner Weiss

No tenemos información sobre la estabilidad de los compuestos fenólicos en la cerveza a aproximadamente 4 ° C. Aún así, las concentraciones de compuestos fenólicos que permanecen en las cervezas de naufragio fueron similares a las encontradas en una cerveza fermentada en la base (Olvi Sandels) y en una cerveza de trigo moderna (Paulaner Weiss).

Paulaner Weiss contenía 5-20 veces más 4-vinylguaiacol (sabor a clavo) que las cervezas naufragadas. Y proporciones mucho más pequeñas de las formas libres de ácidos ferúlico, sinapic y p-cumárico. 4-Vinylguaiacol se forma por la descarboxilación del ácido ferúlico (libre). Catalizado por la fenilacrilato descarboxilasa (Pad1). Pad1 está ausente de las cepas de fermentación inferior (lager) de la levadura de cerveza. Pero presente en algunas cepas de fermentación superior. Incluidas todas las cepas probadas utilizadas para la producción de cervezas de trigo. Y en levaduras Brettanomyces (Dekkera) y algunas bacterias de ácido láctico.

 

Ácido ferúlico

Los resultados sugieren que todo el ácido ferúlico libre en Paulaner Weiss se descarboxiló a 4-vinilguaiacol. En contraste, la mayoría de los microorganismos responsables de la fermentación de las cervezas de naufragio no produce Pad1 activo.

Las pequeñas cantidades de 4-vinilguaiacol encontradas en las cervezas naufragadas y las otras dos cervezas de referencia pueden derivarse de la degradación térmica del ácido ferúlico durante la ebullición del mosto. Las muy pequeñas cantidades de 4-etilguaiacol en ambas cervezas naufragadas sugieren ese Dekkera spp. no contribuyeron significativamente a su fermentación. Esto se debe a que estas levaduras producen grandes cantidades de etilfenoles.  Los niveles de ácido ferúlico total y libre están de acuerdo con los informados por Vanbeneden et al. Para 58 cervezas de muchos tipos (unidos, 11.4 ± 2.6 mg L-1, libre, 1.3 ± 0.8 mg L-1). Excepto que la concentración de ácido ferúlico libre en Paulaner Weiss fue menor que en muchas cervezas de trigo (0.81 ± 0.44; n = 9).




Resumen del análisis de la cerveza más antigua del mundo

En resumen, estas dos botellas de alrededor de 170 años de edad contenían dos cervezas diferentes. Una (C49) saltaba con más fuerza que la otra (A56). Con las variedades bajas de lúpulo que producían a-ácido, comunes en el siglo XIX. Ambas cervezas exhibieron perfiles típicos de compuestos de sabor derivados de levadura y de fenólicos.

El conocimiento actual de la estabilidad química y microbiológica a largo plazo de estos compuestos no es adecuado para evaluar qué tan de cerca los perfiles observados indican el sabor original de las cervezas. Los sabores de estos compuestos estaban ocultos por niveles muy altos de ácidos orgánicos, probablemente producidos por el deterioro bacteriano. La composición de la mezcla microbiana utilizada para producir estas cervezas no está clara. Pero, probablemente, no incluyó muchas cepas que producen la enzima Pad1. Responsable de los fenoles volátiles característicos de las cervezas de trigo. La actividad de Pad1 es común en la levadura silvestre, y su ausencia sugiere que las levaduras empleadas fueron domesticadas en lugar de silvestres.

Los autores del análisis, de la cerveza más antigua jamás hallada, declaran no tener ningún interés financiero en competencia.


Fuente: ACS Publications